RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul （浓度100ng）引物上下游各1u

来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/04/29 04:33:40
RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul （浓度100ng）引物上下游各1u
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RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul （浓度100ng）引物上下游各1u
RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,
最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,
我的PCR条件是这样的
模板1ul （浓度100ng）
引物上下游各1ul （浓度10uM/L）
pcr mix 10ul （用过biotek的mix,也用过takara 的EX Taq HS）
rnafree水 7ul
94℃ 5min
94℃ 30s
55-60℃ 30s
72℃ 1min
72℃ 10min
目的条带从173到690不等
内参跑出来了而且很清晰,所以我觉得我的cdna模板没有问题,
一开始认为是引物问题,就又查阅了很多英文文献,把引物全都用Oligo7软件验证了,选择了最理想的几对引物,
现在很困惑,想请高手们帮我分析下原因,
自己也查阅过网上的解答,
1.引物浓度问题,引物浓度过大会引起二聚体,但是我查阅过有些文章说引物的工作浓度20uM/L比较合适,所以我20ul体系各加1ul似乎不是很高啊,而且内参也是这个加的这个量,内参跑出来了
2.退火温度问题,退火温度我做过梯度,一样,都没有条带,只有二聚体
3.模板浓度问题,我的模板浓度是100ng,不知道是不是合适
4.Mg2+浓度问题,有不少文章提到Mg2+浓度对实验影响很大,但是我不知道如何调整,Mg2+应该是在我买的pcr mix里面吧?那减少mix的量?如果这样的话酶的量不是也少了么
5.引物设计的问题,我发现primer5和Oligo7验证的结果很不一样啊,primer5设计出来的引物用OLigo验证都不太好,Oligo设计出来的引物,用primer5验证都很差,所以我没敢自己设计,还是找了很多文献,用Oligo验证,我选择的几对引物中,虽然有的显示会形成二聚体,但△G都比较低,在PCR那个选项出来的结果中也都没有提示,说明应该可以接受啊.
6.有不少文献中的引物经过Oligo验证,都提示 上下游引物溶解温度差别大,所以我没有选用,我一直很困惑,很多文献的引物我验证了都不太好,为啥人家还能做出结果呢?
7.最后还有个问题就是加试剂顺序的问题,我喜欢先加水,然后加mix,然后加引物,最后加模板,这样是不是不太好,是不是应该最后加mix?
暂时这么多问题,再做不出来我要崩溃了- -
补充一个问题,
8.酶效率问题,会不会是我的酶效率不好呢?预变性时间5min应该不短了吧,如果循环中的变性时间加到45s试试会不会有改善呢?

RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul （浓度100ng）引物上下游各1u
1. 楼上说的都很有道理.不同的Taq确实效果很不一样.在我所使用过的几十种酶中,发现凡是遇到困难的模板,Qiagen 的HOTSTART MASTER MIX PLUS一般都可以得到产物,所以我强烈推荐（可以试试配合Q SOLUTION一起使用,一般免费索取）
2. 另外就是,你的目标基因的表达量是不是很低?你的PCR目的是什么?建议先找一个表达丰度高的体系,验证一下你的引物是否工作.对于极低表达丰度的目标,一轮PCR很有可能得不到产物,这是建议使用NESTED PCR,就是设计2套嵌套的引物,第一轮先用外面的那对,理论上可以得到一个比较大的产物（跑胶不一定能看到）,然后稀释PCR产物50倍,再用里面那对引物扩一次,一般可以得到跑胶看得见的产物量.
3. 关于引物设计,推荐使用Primer3 plus,这是免费的网上设计软件,很好用.比你用的那2种引用次数多很多.你Google一下就可以了.

RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul （浓度100ng）引物上下游各1u RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体,没有目的条带,更换引物了也这样,最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带,我的PCR条件是这样的模板1ul （浓度100ng）引物上下游各1u RT-PCR只有引物二聚体而没有目的条带怎么办?我已经重新设置引物了 PCR的引物二聚体怎么判断PCR产物电泳,在100到250BP之间有一条亮的带.这是不是引物二聚体.两条引物是19和20BP 减少PCR产物中引物二聚体的方法? 普通PCR 为什么只有引物二聚体没有目的条带? PCR只有引物二聚体的条带,没有目的基因条带 pcr如果只有引物二聚体时应该怎样调整 PCR产物问题如图~第一张是taq酶跑出来的条带~有产物,大小780bp~marker是DL2000而第二次是高保真酶跑出来的电泳图,没有我的目的产物,只有很多二聚体这是为什么呢?我用的引物都是一样的~2次PCR CTAB提取白粉菌DNA后PCR扩增电泳结果只出现了引物二聚体能说明退火温度合适吗,实验失败的原因会是什么呢 如何通过降落PCR减少多重PCR产物中的引物二聚体 pcr产物的问题~高手进如图~第一张是taq酶跑出来的条带~有产物,大小780bp~~~marker是DL2000而第二张是高保真酶跑出来的电泳图,没有我的目的产物,只有很多二聚体这是为什么呢?我用的引物都是一 PCR之后电泳没有条带,连引物二聚体都没有?这是怎么回事了?PCR一直都没出现过引物二聚体,引物二聚体是在溴芬兰的前面么? PCR产物引物二聚体严重,目的片段很淡,怎么解决啊? PCR引物二聚体太亮怎么办 电泳PCR结果比Marker最小片段还靠前,是什么原因提取叶蜂的DNA后,用COI的引物PCR扩增,电泳结果比Marker最小片段还靠前.老师说可能是引物二聚体,但不能确定,请教各位专家是什么原因造成的? 反转录cDNA第一链,进行PCR扩增,只有引物二聚体,这是为什么呢?Oligo(dT)反转录,目的片段2700bp,引物二聚体小于100bp 荧光定量pcr引物有多少引物二聚体合适...