作业帮基因带六个his标签,蛋白纯化时为何挂不上镍柱求解
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/04/30 01:08:04
基因带六个his标签,蛋白纯化时为何挂不上镍柱求解
基因带六个his标签,蛋白纯化时为何挂不上镍柱求解
基因带六个his标签,蛋白纯化时为何挂不上镍柱求解
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等待高人回答txstbbm(站内联系TA)可能情况：
1,ORF不完整或者不是预期的ORF,His没表达出来
2,His被空间结构所掩盖,建议变性后再过柱cloudy3197(站内联系TA)同一ls,可能跟蛋白空间结构有关,变性后再上柱.
2.柱子是新的还是以前用过的,旧的应该很好的处理一下,
3.缓冲液很重要,蛋白与柱子结合是靠离子螯合,反应环境很重要
好好做好每一步!stella0xhx(站内联系TA)首先感谢各位的解答啊!不过问题还是没有解决.那个重组基因是测过序的,没有内含子的,也做过SDS－凝胶蛋白电泳,蛋白表达正确且可溶性也好,就是做纯化,挂不上柱,我想得到的是纯化后有活性的蛋白,因为后续还要做其它的用.所以不能变性后挂柱啊!各位还有什么高招啊?小妹先谢过了.zhaocy8903(站内联系TA)用其它纯化手段anik(站内联系TA)有可能是你的his 标签掉了,另一个就是你的镍柱没有还原彻底.wjswj(站内联系TA)曾经傻乎乎的用TE缓冲液溶蛋白去挂镍柱,结果……后来想想真好笑：）txstbbm(站内联系TA)这样呀,不变形的话也可以尝试做个活性蛋白电泳,然后切胶回收吧!peng5053(站内联系TA)我建议你做一个正对照,用一个完好的his标签的蛋白去做纯化,在通过你的结果去分析问题到底出在那个地方!tiani_tan(站内联系TA)用western验证一下是否有该标签,看一下缓冲液里有没有能够和ni结合的物质lsbrc(站内联系TA)1.首选确定你的His融合是可溶性表达；
2.确定你的Ni株没有问题,注意Ni有没有掉下来,建议对Ni柱进行清洗,然后再生.
3.改变Binding Buffer的pH（在不影响活性情况下,建议提高pH可增加Ni的亲和力）、盐浓度、添加Triton、NP40等；
我最后是将组氨酸标签融合到了基因序列的后面jerryqpr(站内联系TA)1,western检验一下你的蛋白是不是有his标签
2,你的镍柱是不是有问题,是否需要再生了再用
3,你设计引物加入his标签的时候是否有误,6个his密码子不能是一样的,如果his标签设计在c端的话很可能这些his没有表达出来.ly888lsp(站内联系TA)1,ORF不完整或者不是预期的ORF,His没表达出来
2,His被空间结构所掩盖,建议变性后再过柱一只鱼ddtt(站内联系TA)你的蛋白表达是在包涵体中表达吗?是的话那就必须先变性,如果以后要用有活性的蛋白,那你就得进行复性后再用.另外可能是你的镍没有挂好.
只是个小建议,说的不对还请指教.秀才ecust(站内联系TA)binding buffer不要含咪唑,直接上样,再用低浓度的洗脱试下!保证成功!