作业帮蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/04/30 01:28:44
蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么
蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么
蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么
Ni柱中的氯化镍可以与有HIs（组蛋白）标签的蛋白结合,也可以与咪唑结合.
步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生,也就是往柱子里倒氯化镍,一个柱长体积就行了,然后平衡柱子,拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境,我一般平衡4个柱长,然后蛋白上样,你可以让他自己挂,这样挂柱子的效果好一些,如果流速太慢,可以加个恒流泵,但是一定不能太快,太快挂柱效果差,当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的一头接你装蛋白的烧杯,从柱子中留下来的液体还用同一个烧杯接回去.挂完之后,按理想来讲,你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了,杂蛋白多数在烧杯里,留下来了,当然肯定有少量杂蛋白也挂上了,这时候你要梯度洗脱,拿咪唑和你的buffer配,一般从0 20mM 40mM.100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的是咪唑的终浓度.咪唑加入之后,会和蛋白争夺与Ni的结合位点,杂蛋白、你的目的蛋白,会在不同的浓度被洗脱下来,洗完之后,你可以用200mM咪唑洗柱子,清理一切蛋白,然后平衡几次,是否选择重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
过的蛋白用不同的管子收下,然后SDS-page检测在哪个管子里.
这是我的经验,楼主可以多方面参考下别人的.喜欢推荐我的答案哦,\(≧▽≦)/~
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楼上说的基本对，但基本上里面填料时硫酸镍，因此柱子可以和碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。这时候再用咪唑洗脱，梯度洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集浸出液，那么里面就是你要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。现在的柱子大多是预装柱，也就是不用自己填柱，就是装好镍的傻瓜柱，也不贵，...
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楼上说的基本对，但基本上里面填料时硫酸镍，因此柱子可以和碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。这时候再用咪唑洗脱，梯度洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集浸出液，那么里面就是你要的目的蛋白，然后透析掉咪唑就行了。现在的柱子大多是预装柱，也就是不用自己填柱，就是装好镍的傻瓜柱，也不贵，上样，洗脱，基本两个步骤就结束了。剩下的看你怎么处理了。可以参考楼上的。不会再问。
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