影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些,分别有怎样的影响?

来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/05/15 21:53:49
影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些,分别有怎样的影响?
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影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些,分别有怎样的影响?
影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些,分别有怎样的影响?

影响琼脂糖凝胶DNA迁移率的因素有那些,分别有怎样的影响?
影响DNA迁移率的因素主要有DNA的片断大小,DNA的结构.
DNA片断越小,在电泳是迁移越快,反之,则越慢.
DNA通常有三种不同的构象:共价闭合环状、线型、开环型.
共价闭合环状的迁移速度最快,其次为线状,开环型最慢.

胶浓度越高,跑的越慢,电压越高,跑的越快,DNA构型越接近线性,跑的越慢。

1、核酸的性质
核酸的电荷量,分子大小,分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子,在凝胶电泳中,分子量的常用对数与泳动 率成反比关系,一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象,但分子的空间构象也影响泳动速率,如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是:闭环型>线性>单链开环型。
对于单链RNA或DNA,其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影...

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1、核酸的性质
核酸的电荷量,分子大小,分子的空间构象等决定了不同的核酸分子具有不同的迁移率。对于线状双链DNA分子,在凝胶电泳中,分子量的常用对数与泳动 率成反比关系,一般双链DNA基本上不存在影响迁移率的复杂构象,但分子的空间构象也影响泳动速率,如分子量相同的质粒DNA 迁移速率则是:闭环型>线性>单链开环型。
对于单链RNA或DNA,其在凝胶电泳中的迁移率受碱基组织和序列的影响,同等大小的核酸可能由于空间构象不同而使迁移率不同,故可利用变性凝胶电 泳分离纯化单链核酸。
2、凝胶孔径的大小:
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel, PAG)是核酸凝胶电泳常使用的支持材料,通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小,能分离不同分子量的核酸片段,琼脂糖凝胶的孔径大,分辨率低,但分离范围广,约100bp~50kb的DNA;PAG的孔径小,分离小片段 (5~500bp)DNA效果较好,甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。凝胶孔径的大小是影响核酸在凝胶电泳中迁移率的最基本因素,它决定了能被分离的 片段的大小。
3、电场强度和电场方向:
低电压时,线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比,通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。随电场强度增加,高分子量的DNA片段的 迁移率将以不同的幅度增加,使凝胶的有效分离范围缩小。对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜,以取得较好的分辨 力和整齐的带型。如果电场呈周期性变化,各种分子量的DNA片段为适应新的电场变化所需的时间将不同,分子量越大,则所需的时间越多。因此可以通过脉冲电 场凝胶电泳分离极大片段的DNA。
4、电泳环境
缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。Tris-Cl缓冲体系中,由于Cl-的泳动速度比样品分子快得多,易引起带型不均一现象,所以常采用含EDTA的Tris-醋酸(TAE)、Tris-硼酸(TBE)和Tris-磷酸(TPE)三种缓冲体系。传统最常用的是TAE,但其缓冲能力很低,长时间电泳需要正、负电极贮 液槽之间进行缓冲液循环,并经常更新TAE。TBE与TPE有较高的缓冲能力,现多用,但因TBE中硼酸易与琼脂糖形成复合物,在短时间(≤5h)琼脂糖凝胶电泳时,常用TAE,而在PAGE中常用TBE。双链线状DNA在TAE中迁移速率比TBE或TPE 中快将近10%,但各个缓冲体系的分辨能力几乎相同,(对超螺旋DNA,在TAE 中的分辨率比在TBE中的更好)。凝胶电泳后要回收DNA片段,不宜采用TPE缓冲体系,这使DNA片段含较高的磷酸盐、易与DNA一起沉淀,而影响一些 酶反应,缓冲液中含EDTA,目的在于螯合二价离子,抑制核酸酶以保护核酸。
缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比,电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下(如误加10×电泳缓冲液),溶液导电性 极高并明显产热,可能引起凝胶熔解及DNA变性。
缓冲液的pH值影响DNA迁移率,溶液的pH值远离样品等电点时,样品荷电量越多,泳动越快,核酸电泳液常用偏碱性或中性条件,使核酸带负电荷,向 正极泳动。
在进行电泳时,荧光染料EB可插入到碱基中,从而增加线状和开环DNA的长度,使其刚性更 强,并会使线状DNA的迁移率降15%,另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。

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