原核生物和真核生物的启动子结构的差异请问原核生物和真核生物（RNA聚合酶Ⅱ）的启动子结构的差异是什么?

原核生物和真核生物的启动子结构的差异请问原核生物和真核生物（RNA聚合酶Ⅱ）的启动子结构的差异是什么?
原核生物和真核生物的启动子结构的差异
请问原核生物和真核生物（RNA聚合酶Ⅱ）的启动子结构的差异是什么?

原核生物和真核生物的启动子结构的差异请问原核生物和真核生物（RNA聚合酶Ⅱ）的启动子结构的差异是什么?
根据α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制,以氯霉素乙酰转移酶基因（CAT\x1b）作为报道基因进行体内表达实验,证明T7噬菌体启动子可为真核生物RNA聚合酶所启动.应用建立的竞争性DNA-蛋白质凝胶沪动技术,分别以TATA框,CAAT框,GC框和八核苷酸序列（octamer）为竞争性寡核苷酸分子,发现人工合成的T7启动子可能与TFD起始转录因子结合,形成DNA-核蛋白质结合物.TATA框和八核苷酸序列分别接入T7启动子上游,CAT实验显示八核苷酸序列可以增强RNA聚合酶对T7启动子的转录起始作用.实验结果表明T7启动子可作为RNA聚合酶的顺式作用因子.
1 材料和方法
1.1 材料
质粒pT7CAT为前文〔2〕所构建.各种酶试剂和CAT测试盒购自Promega公司.序列测定试剂盒购自USB公司.α-鹅膏蕈碱(α-amanitin）购自BioLabs公司.BioTeZ公司合成寡聚核苷酸：T7启动子2条正负序列为T71：5′-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3′；T72序列为5′-CTCCCTATAGTG-GTCGTATTA-3′.TATA框2条正负链分别为TA1：5′-ATAAAA-3′；TA2：5′-TTTATA-3′.CAAT框2条正负链分别为CA1：5′-GCCAATCT-3′；CA2：5′-GATTGGCC-3′ .GC框2条正负链GC1：5′-GGCGG-3′；GC2：5′-CGCCC-3′.八核苷酸序列2条正负链分别为OC1：5′-TTTGCAT-3′；OC2：5′-TGCAAAT-3′ .
1.2 方法
1.2.1 常规分子生物学技术 DNA分子的体外重组,大肠杆菌DM52的转化,重组DNA分子的序列测定证实,磷酸钙朌NA沉淀法转化CHOJT细胞和HeLa细胞培养根据文献〔5〕提供的方法进行.
1.2.2 CAT活性检测 CAT实验主要按照文献〔2,6〕方法进行.106的CHO JT细胞抽提物与0.5\x1bCi的14C-氯霉素在37℃下保温1h.点样于TLC硅胶板上,氯仿和甲醇中薄层层析分离产物,放射性自显影鉴定.其中进行α-鹅膏蕈碱敏感实验时,培养的细胞在DNA转染后,分别在不同的时间内在细胞培养液中添加10g／ml的α-鹅膏蕈碱,35h培养后收获细胞,测试CAT活性.
1.2.3 竞争性凝胶泳动实验 HeLa细胞常规培养至总量1010个,根据Andrews方法〔7〕制备核提取物.人工合成的T7启动子2条T71和T72寡聚核苷酸片段用γ-32P-ATP和T4多聚核苷酸激酶进行末
端标记.标记产物经Sephadex G-25柱分离纯化.常规的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验如下:20μl体积的反应液中含有cpm值约为5\x1b000的标记寡聚核苷酸,10μg的核抽提物,0.5μg的Poly（dI／dC）,10mmol／L Tris-HC1(pH7.9）,10mmol／\x15L MgCl2,50mmol／L KCl, 1mmol／L DTT, 0.5mmol／L EDTA和5%的甘油,室温下放置30min.DNA-蛋白质复合物于5%低离子非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,80℃真空干胶,－70℃放射自显影.进行竞争性的DNA-蛋白质结合凝胶泳动实验时,寡聚核苷酸序列除了T7启动子外,分别加入100倍（克分子数）于T7启动子的寡核苷酸序列作为DNA结合蛋白的特异性竞争性序列,其余步骤按常规的凝胶泳动实验进行.
2 结果
2.1 T7启动子为真核生物RNA聚合酶Ⅱ所识别
真核生物转录系统共有3种RNA聚合酶：RNA聚合酶（PolⅠ）、RNA聚合酶（PolⅡ）和RNA聚合酶（PolⅢ）.这些RNA聚合酶分别识别不同类型的启动子,并对α-鹅膏蕈碱表现出游同的敏感度．α-鹅膏蕈碱不影响Pol Ⅰ的启动转录活性,但对PolⅡ和Pol Ⅲ的转录起抑制作用,不过其抑制浓度不同,当α-鹅膏蕈碱浓度在1μg／ml以上时,将抑制PolⅡ的活性；α-鹅膏蕈碱浓度在100μg／ml以上时,则抑制Pol 的活性,体内和体外实验都表现出同一现象〔8〕.根据这一机制,将含有在T7启动子下游组装有CAT基因的pT7CAT质粒3μg转染CHO JT细胞（1×105）,转染后的细胞在5h、20h、30h时分别加入10μg／ml的α-鹅膏蕈碱,各批细胞均培养35h,进行CAT实验（图1）：0h和20h时加入α-鹅膏蕈碱,基本上不能检出CAT活性,30h时加入α-鹅膏蕈碱的转染细胞能检出约20%的CAT活性.10μg／ml的α-鹅膏蕈碱抑制了真核生物转录系统对T7启动子的启动作用.实验显示真核生物RNA Pol Ⅱ负责对T7启动子的转录起始.
图1 α-鹅膏蕈碱对T7启动子控制的报道基因产物CAT活性影响检测
A、B、C：分别为转染细胞收获前30h、15h、和5h时加入α-鹅膏蕈碱的实验；D：转染细胞不加α-鹅膏蕈碱
Fig.1 CAT activity from T7 promoter with α-amanitin in the CHO cells A,B,C:CAT activity from the cells exposed to α-amanitin for the last 30h,15h,5h before cells harvesting,respectively;D:CAT activity fromthe cell in absence of α-amanitin
2.2 T7启动子是TBP蛋白的结合序列
真核生物RNA聚合酶识别的启始子控制mRNA的转录,此类启动子包含有多种顺式作用因子,常见的顺式作用因子有TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列.这些序列和相应转录因子结合在转录起始中起作用.T7启动子为RNA聚合酶所识别,启动报道基因的转录.为研究T7启动子与转录因子的作用,利用竞争性凝胶泳动技术（competitive electrophoretic mobility shift assay, CEMSA）来检测T7启动子作为真核生物RNA聚合酶Ⅱ顺式作用因子的功能.实验将已知相应结合蛋白的TATA框、GAAT框、GC框和八核苷酸序列（octamer）作为竞争性分子来测定T7启动子的结合蛋白因子（图2）：在没有竞争性分子存在时,人工合成23bp的T7启动子,可与HeLa细胞核抽提物形成一个复合物（图2,A）；当加入标记的T7启动子和未标记的TATA序列时（克分子数比例为1100）进行竞争实验时,原先的DNA－蛋白质带放射性强度大减弱（图2,B）,表明TATA序列与T7启动子竞争结合蛋白质因子,由于未标记的TATA序列数量上远多于标记的T7启动子序列,所以放射性DNA-蛋白制裁带减弱,结果显示T7启动子能与真核生物TATA结合蛋白结合.图2,C、图2,D和图2,E中的竞争性分子分别是CAAT框、GC框和八核苷酸序列,这些实验中的放射性DNA-蛋白质带依然保持,表明T7启动子结合的蛋白与上述3个DNA序列识别的蛋白质因子是不一样的.TATA框、CAAT框、GC框和八核苷酸序列分别为TBP、CTF／NF1、SP1和Oct-1所特异性结合〔9〕,因此竞争性凝胶泳动技术表明T7启动子在真核生物转录系统中是与TBP蛋白质结合的顺式元件.
图2 竞争性凝胶泳动实验放射性自显影图
A：无竞争性分子时的CEMSA实验；B、C、D、E：竞争分子分别为无标记的TATA框、CAAT框、GC框、和八核苷酸的CEMSA实验
Fig.2 Autoradiograms of competitive electrophoretic mobility shift assay
A:CEMSA with end-labelled T7 promoter;B,C,D,E:CEMSA with end-labelled T7 promoter and TATA box,CAAT box,GC box ,and octamer ,respectively
2.3 八核苷酸序列和TATA序列对T7启动子的作用
质粒pT7CAT是将CAT基因接入pGEM质粒T7启动子下游构建而成,利用质粒T7启动子上游第15个碱基的Pvu 酶切位点.将人工合成的TATA序列和八核酸序列分别插入pT7CAT质粒T7启动子上游,构建成pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒.测序证实两个调控序列已插入PvuⅡ位点（图3和图4）.将pT7TATACAT和pT70CTCAT质粒各3g转染CHO JT细胞（5×104）,转染后的细胞培养30h,进行CAT实验：pT7TATACAT和pT7CAT质粒表达的CAT基因产物活性差别不大（图5,A和图5,B）.但pT70CTCAT质粒表达的CAT活性比pT7CAT表达的活性要强得多（图5,C和图5,D）,显示八核苷酸序列能增强T7启动子的RNA聚合酶Ⅱ所启动的功能.在真核生物转录中TATA序列作为定位因子起作用的,而八核苷酸序列能增强真核生物启动子的转录功能.实验结果证明了T7启动子能作为真核生物转录启动元件的功能.
图3 重组进pT7质粒的TATA框序列
Fig.3 TATA box inserted in pT7CAT
图4 重组进pT7质粒的八核苷酸序列
Fig.4 Octamer inserdted in pT7CAT
图5 调控序列对T7启动子启动CAT基因表达的影响
A：T7启动子控制下的CAT活性；B：T7启动子和TATA框控制下的CAT活性；C、D：T7启动子和八核工业苷酸序列控制下的CAT活性
Fig.5 CAT activity from T7 promoter under the sequence elements
A:CAT activity from T7 promoter under the sequence elements control of T7mpromoter,B:CAT activity from teh cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and TATA box;C,D:CAT activity from the cells transfected with CAT gene under control of T7 promoter and octamer
3 讨论
原核和真核细胞的转录系统有着明显的差异,原核生物较为简单,通常细胞内只有1种RNA聚合酶,真核生物细胞内则有3种RNA聚合酶.从整体的转录机制看,Pol Ⅰ和PolⅢ 的转录系统较为简单,更类似于原核生物,但α-鹅膏蕈碱实验显示人微言轻原核系统的T7启动子在真核生物细胞内的作用是依赖于PolⅡ系统.PolⅡ系统是细胞内最为复杂的转录系统,其识别因子多达数十个,T7启动子长仅为23bp,它为何种蛋白质因子所识别,这是人们关心的问题.竞争性DNA－收据结合凝胶泳动实验显示T7启动子结合的反式作用因子与TATA序列结合的因子是一样的.目前已经知道识别TATA序列是TFⅡD 因子,TFⅡD因子是PolⅡ系统基础转录的一个重要反式作用因子,它含有TBP和TAFs两类蛋白质因子,其中TBP是DNA序列识别因子,结合到特异的序列上,从而触发RNA聚合酶转录的起始〔10〕.T7启动子能与TFⅡD结合,显示了该启动子在PolⅡ系统中作为类似TATA序列顺式作用因子的可能性.真核生物TATA序列具有保守性,其碱基以TA碱基对为主,本实验采用的T7启动子共有23bp,它的序列5′端的5个碱基（TAATA）是AT碱基对,可能这一区域是TFⅡD因子的TBP蛋白识别结合序列,其突变鉴定研究正在进行中.
真核生物PolⅡ系统包含有许多顺式作用因子,这些顺式作用因子以“Mix and Match”模式起作用,即不同的顺式作用因子共同或协同起作用.如果T7启动子作为PolⅡ系统的一个顺式作用元件,它将具有与其他顺式作用元件相互作用调控转录起始的功能.本文实验中将八核苷酸序列置于T7启动子上游,增强了转录的起始,表明顺式作用元件八核苷酸序列能与T7启动子作用,即T7启动子确实也是PolⅡ系统的一个顺式作用元件.但当将TATA序列置于T7启动子上游时,并不能增强报道基因的表达活性.从目前实验结果看T7启动子在PolⅡ系统转录中起的作用可能与TATA序列相仿,但加上一个典型的TATA序列也不能增强启动活性,证实了TATA序列与原核生物－10序列功能上的差异,尽管两者都是由TA碱基对组成,但原核生物－10序列与转录的强度有关,而真核生物TATA序列则与转录的定位相关〔4〕.
T7启动子可能作为TATA序列类似功能的特殊的元件被PolⅡ系统识别.但在Pol\x19系统中,TATA序列不象原核生物启动子的－10序列那样是必不可少的,PolⅡ系统最基本和必要的顺式元件是起始子（initiator）, pT7CAT和衍生质粒中T7启动子区域能被Pol系统起始,说明该区域中应具有起始子,或者Pol 系统有目前尚未知的起始机制.从目前研究看,报道基因mRNA5′末端和T7启动子序列分析显示启动子含有一个类似起始子的序列,突变实验也证实该序列的重要性（另文报道）,所以23碱基对的T7启动子可能还包含着类似起始子的顺式作用因子,对它们的研究将促进对Pol Ⅱ系统转录起始的了解.

原核生物启动子：
在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。
例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。
终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。
而弱终止子尽管也有反向重...

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原核生物启动子：
在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。
例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。
终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。
而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。
典型转录终止子的特征：茎环结构，富含GC；含4个以上的U。
原核生物启动子序列包括：CAP序列，增强聚合酶的结合和转录的起始序列（-70~-40）；识别区（-35）；解旋区（-10）；转录起始位（+1）
真核生物启动子：
启动子（promoter）：真核基因启动子是在基因转录起始位点（+ 1）及其5’上游近端大约100~200bp以内（或下游100bp）的一组具有独立功能的DNA序列，每个元件长度约为7~20bp，是决定RNA聚合酶转录起始和转录频率的关键元件。
启动子包括：A。核心启动子（core promoter）：是指足以使RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。其中包括转录起始位点或起始子（initiator）（+1）：一般是A或G及转录起始位点上游-25/-30bp处富含TA的典型元件TATA框。
B。上游启动子元件(upstream promoter element，UPE)：包括通常-70bp附近的CAAT框：GGCCAATCT和GC框：GGGCGG等，能通过TFⅡ-D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。
RNA聚合酶II的启动子:
第一个部位为帽子位点，即转录起始位点。其碱基大多为A（指非模板链），两侧各有若干个嘧啶核苷酸。
第二个部位为TATA框（Hogness box）。它位于-25个bp其共有序列为：TATAA/TAA/T，基本上由AT碱基对所组成，只有很少启动子中有GC碱基对的存在。
第三个部位 为CAAT框。其共有序列为GGC/TCAATCT，一般位于-75（-100～-200）附近。虽然此序列名为CAAT框，但其中头两个G的重要性并不亚于CAAT部分。CAAT框为上游控制元件，为转录所需。
第四个部位是增强子（enhancer），又称远上游序列（far upstream sequence）。一般都在-1OO以上。增强子的作用主要是，对依赖于TATA框的转录和不依赖TATA框的转录都有增强效应，但对前者增强效应高；距离效应和极性效应。

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